Hasil Laboratorium: Polymerase Chain Reaction (PCR)

Daftar Isi:

Hasil Laboratorium: Polymerase Chain Reaction (PCR)
Hasil Laboratorium: Polymerase Chain Reaction (PCR)

Video: Hasil Laboratorium: Polymerase Chain Reaction (PCR)

Video: Hasil Laboratorium: Polymerase Chain Reaction (PCR)
Video: Coronavirus Test: Real time RT-PCR - Animation video 2024, Maret
Anonim

Hasil laboratorium: polymerase chain reaction (PCR)

Polimerase chain reaction (PCR) adalah metode laboratorium terpenting untuk memeriksa struktur molekul halus dari bahan genetik. Ini terdiri dari asam deoksiribonukleat (DNA), yang membangun kode genetik manusia, tetapi juga hewan dan tumbuhan.

Dalam pengobatan manusia, PCR digunakan untuk mengklarifikasi penyakit keturunan dan masalah genetik (risiko penyakit, tes paternitas, dll.), Tetapi juga dalam diagnosis berbagai penyakit menular. Berbeda dengan diagnostik serologis (penentuan antibodi terhadap patogen dalam darah), metode PCR merupakan metode deteksi medis laboratorium langsung untuk klarifikasi penyakit menular.

Di satu sisi, keunggulan PCR adalah ketersediaan hasil tes yang cepat. Selain itu, metode PCR biasanya sangat sensitif.

navigasi

  • Lanjut membaca
  • lebih lanjut tentang masalah ini
  • Saran, unduhan & alat
  • Apa itu polymerase chain reaction (PCR) dan apa yang diselidiki?
  • Bagaimana cara kerja PCR?
  • Hasil tes apa yang diberikan PCR?
  • Adakah perkembangan lebih lanjut dalam PCR konvensional?
  • Apa area utama aplikasi PCR?
  • Apakah ada nilai referensi untuk hasil tes PCR?

Ini berarti bahwa bahkan jumlah terkecil materi genetik dari suatu patogen (bakteri, virus, dll.) Mengarah pada hasil positif yang andal dalam periode deteksi masing-masing patogen dalam bahan uji yang sesuai. Terutama darah, tetapi juga cairan tubuh lainnya (dahak, urin, minuman keras, dll.) Digunakan sebagai bahan pemeriksaan untuk metode PCR.

Apa itu polymerase chain reaction (PCR) dan apa yang diselidiki?

Reaksi berantai polimerase ("Polymerase Chain Reaction" - PCR) adalah metode laboratorium terpenting untuk memeriksa struktur molekul halus dari bahan genetik. Untuk alasan inilah prosedur investigasi ini juga disebut apa yang disebut

"Diagnostik molekuler"

Basis materi genetik (juga disebut "materi genetik") adalah molekul rantai panjang khusus:

yang "DNA" (asam deoksiribonukleat)

Pada manusia, materi genetik yang terdiri dari DNA untai ganda (dua untai komplementer) terletak di inti semua sel tubuh, di mana semua sel tubuh individu memiliki materi genetik yang identik. Selain itu, komposisi yang tepat dari susunan genetik masing-masing individu adalah unik - sebanding dengan sidik jarinya, yang juga unik untuk setiap orang.

Untuk alasan ini, materi genetik juga disebut

"Kode genetik" berarti karena cetak biru dari semua struktur tubuh seseorang dipetakan dalam bentuk terenkripsi ini dan disimpan dengan cara ini dan dapat diteruskan

Di dalam inti sel tubuh, DNA berada dalam urutan khusus yang dikenal sebagai

Disebut "kromosom" (tubuh keturunan). Pada manusia, hal ini selalu terjadi secara berpasangan dalam sel tubuh, yang satu diwarisi dari ibu dan yang lainnya dari ayah. Dalam pengertian ini, semua sel tubuh seseorang mengandung total 46 kromosom - 22 pasang yang disebut autosom dan satu pasang yang disebut kromosom seks

Dengan bantuan metode laboratorium PCR, di satu sisi, struktur halus DNA manusia dapat diperiksa, yang penting untuk mendiagnosis penyakit atau untuk mengklarifikasi pertanyaan spesifik:

  • Klarifikasi penyakit keturunan,
  • Penilaian risiko penyakit,
  • Investigasi kekhasan bawaan metabolisme,
  • analisis forensik (disebut "forensik") (mis. bukti garis ayah) dan banyak lagi

Di sisi lain, manusia tidak hanya memiliki susunan genetik yang sesuai, tetapi sebenarnya semua bentuk kehidupan di bumi memiliki susunan genetik tertentu:

  • Hewan,
  • Tanaman,
  • Jamur,
  • Bakteri,
  • Virus,
  • Parasit dll.

Susunan genetik dari bentuk kehidupan ini juga terutama terdiri dari DNA atau, dalam kasus beberapa virus, juga dari RNA (asam ribonukleat), yang berbeda dengan DNA, beruntai tunggal. Oleh karena itu, dalam diagnosis medis, PCR juga digunakan untuk mengklarifikasi berbagai penyakit menular:

  • infeksi bakteri (misalnya tuberkulosis, penyakit menular seksual akibat bakteri),
  • infeksi virus (misalnya virus hepatitis, infeksi HIV),
  • infeksi parasit (misalnya malaria) dan banyak lagi

Bagaimana cara kerja PCR?

Metode PCR dikembangkan pada tahun 1983 oleh ahli biokimia Amerika Kary B. Mullis dan pada dasarnya didasarkan pada dua prinsip:

  • Perkalian ("amplifikasi") dari sebagian kecil materi genetik (DNA atau RNA) juga
  • Deteksi dan identifikasi produk yang dikalikan ("diperkuat") dari amplifikasi.

Oleh karena itu, komponen berikut diperlukan untuk melaksanakan PCR:

  • bahan uji (misalnya sampel darah, sel atau jaringan),
  • reagen tertentu ("polimerase", "primer", "nukleotida" [ini adalah blok pembangun DNA] dll.) dan peralatan laboratorium untuk amplifikasi materi genetik juga
  • sistem deteksi untuk produk PCR.

Dalam hal reagen dan peralatan laboratorium yang diperlukan untuk melakukan PCR, enzim berikut merupakan inti dari keseluruhan proses PCR:

yang Taq polimerase

Ini adalah enzim yang diperoleh dari mikroorganisme "Thermus aquarius" (Taq) - strain bakteri yang ada di sekitar mata air vulkanik yang panas dan dapat bertahan hidup beradaptasi dengan suhu tinggi lingkungannya.

Keistimewaan Taq polimerase adalah enzim ini juga dapat memenuhi fungsinya pada suhu tinggi di atas 50 ° Celcius (C) - yaitu

perbanyakan ("amplifikasi") DNA

Selain Taq polimerase, harus ditentukan secara tepat sebelum analisis PCR bagian mana dari DNA yang akan diperiksa. Untuk tujuan ini, Anda memerlukan fragmen DNA pendek, yang struktur halusnya sesuai dengan wilayah target DNA terkait dengan kode genetik masing-masing (“urutan DNA). Fragmen DNA ini disebut

"Primer" disebut

Proses amplifikasi aktual dalam konteks PCR akhirnya terdiri dari langkah-langkah berikut:

  • Ekstraksi materi genetik (DNA atau RNA) dari bahan uji.

    Saat memeriksa RNA, urutan kode asam ribonukleat terlebih dahulu harus diubah menjadi urutan kode DNA, yang harus dilakukan dengan enzim "reverse transcriptase" dalam langkah analitis sebelum amplifikasi yang sebenarnya

  • Amplifikasi materi genetik dalam beberapa langkah ("siklus"):

    • Langkah pertama - "denaturasi DNA": dengan memanaskan (95 ° C) DNA beruntai ganda, DNA itu melebur menjadi untaian tunggal.
    • Langkah kedua - "Anil": pada suhu yang lebih rendah (sekitar 55 ° C) "primer" sekarang dapat menempel pada urutan target DNA mereka.
    • Langkah ketiga - "Perpanjangan": pada suhu 72 ° C, enzim Taq polimerase sekarang meluas ("memanjang") urutan awal primer menggunakan apa yang disebut "nukleotida" (ini adalah blok pembangun DNA) dan membangunnya dengan cara ini molekul DNA baru yang memanjang.

Karena langkah satu hingga dua diulangi dalam beberapa siklus, rantai DNA yang lebih panjang dan lebih panjang dibuat, dari situlah nama proses laboratorium ini "reaksi berantai polimerase" berasal.

  • Analisis rantai DNA yang baru dibuat (disebut "produk PCR"):

    Pada akhir reaksi berantai (siklus), produk PCR - yaitu molekul DNA yang baru dibuat - diperiksa dan dievaluasi secara kualitatif atau kuantitatif. Ada banyak kemungkinan untuk evaluasi ini sendiri, sebagian besar didasarkan pada pewarnaan (terutama pewarna fluoresen) dari DNA dan membuatnya terlihat (melalui elektroforesis gel atau deteksi fluoresensi fotometrik)

Hasil tes apa yang diberikan PCR?

Hasil metode PCR modern dapat diringkas dalam dua kelompok:

  • kualitatif dan
  • hasil kuantitatif.

Dalam PCR kualitatif, diperiksa apakah bagian tertentu dari materi genetik (DNA atau RNA) ada dalam materi uji (hasil "positif") atau tidak (hasil "negatif").

Oleh karena itu, PCR kualitatif terutama digunakan untuk memperjelas pertanyaan diagnostik berikut (hasil "ya / tidak"):

  • Diagnosis penyakit keturunan,
  • Klarifikasi mutasi,
  • Pengakuan karakteristik genetik (misalnya kecenderungan untuk penyakit tertentu) dll.

PCR kuantitatif merupakan pengembangan lebih lanjut dari metode laboratorium ini, dimana tidak hanya dideteksi keberadaan area tertentu dari materi genetik, tetapi juga jumlah materi genetik pada saat yang sama. Dengan demikian, PCR kuantitatif terutama digunakan di bidang kedokteran berikut:

  • Sebagai bagian dari diagnosis infeksi, jumlah patogen dalam tubuh pasien dapat ditentukan dengan tepat. Dalam kasus infeksi virus, metode PCR ini digunakan untuk mengobati apa yang disebut

    Viral load diperiksa

Selain itu, PCR kuantitatif juga sangat penting dalam penelitian dasar, dimana tidak hanya pengobatan manusia, tetapi juga sejumlah bidang ilmiah lainnya (kedokteran hewan, biokimia, biologi, dll) mendapat manfaat dari proses ini.

Keuntungan PCR dalam mendiagnosis penyakit menular adalah hasil tes metode laboratorium ini tersedia dengan sangat cepat (biasanya dalam satu hari kerja). Selain itu, PCR adalah metode laboratorium yang sangat sensitif. Ini berarti bahwa bakteri atau virus dalam jumlah terkecil sekalipun dalam bahan uji dapat memberikan hasil positif yang andal.

Adakah perkembangan lebih lanjut dalam PCR konvensional?

Pengembangan lebih lanjut khusus dari metodologi PCR adalah

Multipleks PCR

Pada PCR multipleks, beberapa sekuens target DNA (baca: beberapa primer) digunakan secara bersamaan. Ini menciptakan campuran produk PCR yang harus dideteksi dan dievaluasi sesuai.

Multipleks PCR juga terutama digunakan dalam pengobatan

  • genetika manusia juga
  • diagnosis infeksi.

Keuntungan dari metode ini adalah bahwa secara keseluruhan lebih sedikit materi tes yang harus diperoleh dari pasien dan serangkaian hasil tes dapat dibuat dalam satu langkah analisis. Namun, keuntungan yang berkaitan dengan diagnosis ini diimbangi oleh tingginya harga untuk analisis dalam banyak kasus.

Keistimewaan lain untuk penggunaan PCR adalah proses laboratorium

Pengurutan DNA

Ini adalah kemungkinan diagnostik untuk menguraikan urutan yang tepat dari kode genetik pada pasien. Metode sekuensing juga dapat didasarkan pada teknologi PCR.

Namun, karena pengurutan jauh lebih kompleks dan mahal daripada metode PCR konvensional, saat ini digunakan untuk diagnostik khusus (analisis genom yang diperluas) dan masalah ilmiah.

Apa area utama aplikasi PCR?

Berkenaan dengan bidang penerapan PCR dalam pengobatan manusia, prosedur laboratorium ini digunakan untuk pertanyaan diagnostik berikut:

  • Klarifikasi penyakit keturunan - sudah ada metode PCR untuk lebih dari 600 penyakit keturunan yang berbeda.
  • Farmakogenetika - dengan mempelajari karakteristik genetik metabolisme hati, kesimpulan dapat diambil tentang keefektifan dan dosis obat.
  • Pengobatan tumor ("onkologi") - di satu sisi, PCR digunakan untuk mengklarifikasi faktor risiko penyakit tumor tertentu (misalnya kanker payudara). Di sisi lain, sel dan jaringan dalam tumor yang telah terjadi juga dapat diperiksa untuk mengetahui berbagai mutasi, yang memainkan peran yang semakin penting dalam pengobatan penyakit ini secara khusus.
  • Kedokteran forensik ("forensik") - di sini PCR sangat penting, misalnya, dalam proses paternitas dan dalam kriminalistik ("sidik jari DNA").
  • Pengobatan infeksi - PCR memiliki nilai yang sangat diperlukan dalam diagnosis, perkembangan dan pengendalian terapi penyakit infeksi bakteri, virus dan parasit.

Untuk informasi lebih lanjut tentang kanker, lihat Kanker.

Apakah ada nilai referensi untuk hasil tes PCR?

Berkenaan dengan nilai referensi dalam metode PCR, pertanyaan diagnostik masing-masing harus selalu diperhitungkan. Karena fitur genetik tertentu terdeteksi selama pemeriksaan penyakit keturunan (misalnya analisis mutasi), tidak ada nilai referensi ("positif" atau "negatif") dalam analisis laboratorium tersebut, seperti tidak ada nilai referensi untuk warna rambut, misalnya. Karena warna rambut juga merupakan ciri genetik.

Selain itu, analisis laboratorium untuk sifat bawaan bawaan tunduk pada peraturan yang ketat di negara ini, di mana ketentuan Undang-Undang Rekayasa Genetika Austria (GTG) sangat menentukan (penentuan penyakit yang ada sesuai dengan §65 GTG). Akibatnya, analisis ini hanya dapat dilakukan oleh laboratorium medis setelah konfirmasi tertulis diterima dari orang yang akan diperiksa, wali hukum (dalam kasus anak di bawah umur yang tidak mampu mengambil keputusan) atau perwakilan hukum (dalam kasus orang usia yang tidak mampu membuat keputusan) tentang informasi lengkap yang diberikan oleh dokter yang merawat harus dilakukan sehubungan dengan tes genetik ini (Bagian 69 GTG).

Lebih lanjut, pasien pada umumnya memiliki hak untuk melarang tes genetik dilakukan pada diri mereka sendiri.

Untuk analisis laboratorium PCR genetik non-manusia, bagaimanapun, peraturan yang jauh lebih ketat berlaku. Sebagian besar menyangkut metode laboratorium dari bidang diagnosis infeksi.

Berkenaan dengan nilai referensi metode laboratorium ini, perbedaan harus dibuat antara metode kualitatif dan kuantitatif:

Metode PCR kualitatif biasanya memberikan hasil "positif" atau "negatif", di mana "negatif" biasanya menjadi nilai referensi

Dengan metode PCR kuantitatif, bergantung pada metodenya, nilai ambang batas yang sesuai (yang disebut "batas") ditentukan, dari saat hasil akan dinilai sebagai patologis.

Direkomendasikan: